Nach Bearbeitung der pre-crRNA bildet sich das Molekülpaar crRNA:tracrRNA. Es besteht aus zwei RNAs, die teilweise komplementär sind und durch Basenpaarung zusammengehalten wird. crRNA:tracrRNA bindet an Cas9 und bringt das Protein an die „richtige“ Stelle in der Target-DNA. Dies geschieht durch die Komplementarität zwischen einem Teil der crRNA und der Target-RNA.

Das Molekülenpaar kann durch die künstlich hergestellt sgRNA ersetzt werden, ohne die Funktionsweise des Cas9-Proteins zu beeinträchtigen.

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