29.08.2005

Forschung Projekte

Gezielter Einbau von Genen an bestimmten Stellen im Pflanzengenom

(2001 – 2004) Universität Karlsruhe, Botanik II

Thema

Bei der Transformation von Pflanzen wird die DNA in der Regel ungerichtet, an einer beliebigen Stelle im Genom integriert (illegitime Rekombination). Der gezielte Einbau (homologe Rekombination) würde es ermöglichen, gentechnische Veränderungen an bestimmten Stellen im Pflanzen-Genom vorzunehmen. Dadurch könnten einzelne Gene gezielt ausgeschaltet oder verändert werden.

In diesem Projekt sollte eine Methode entwickelt werden, mit der es möglich ist, DNA an spezifischen Stellen mit Hilfe von gezielten Doppelstrangbrüchen in der Pflanze selber einzubauen. Gleichzeitig soll die illegitime Rekombination unterdrückt werden.

Informationen zum Verfahren:

Zusammenfassung

Es konnte eine neuartige Technik zur Eliminierung von Transgensequenzen aus dem Pflanzengenom etabliert werden.

Es wurden transgene Pflanzen hergestellt, bei denen die Expression bestimmter Proteine, die an der illegitimen Rekombination beteiligt sind, unterdrückt wurde. Leider konnte aber auf diese Weise der gezielte Einbau neuer DNA-Sequenzen an bestimmten Stellen im Genom nicht zusätzlich unterstützt werden. Um dieses Ziel zu erreichen, müssen andere Ansätze verfolgt werden.

Versuchsbeschreibung

Die in dem Projekt angewandte Methode besteht aus zwei sich ergänzenden Ansätzen. Im Fall einer erfolgreichen Erprobung sollen sie miteinander kombiniert werden.

1. Es wird mit einem selten schneidenden Restriktionsenzym namens „I-SceI“ an einer bestimmten Stelle im Pflanzengenom gezielt ein Bruch des DNA-Stranges erzeugt (Doppelstrangbruch). Damit wird die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass die zu übertragende Gensequenz genau an dieser Stelle eingebaut wird. Die Wirksamkeit dieses Verfahrens wird durch ein Testsystem überprüft (durch Reparatur eines defekten Markergens).

2. Es sind Faktoren (aus Arabidopsis) bekannt, die bei der illegitimen Rekombination eine Rolle spielen. Diese können durch Einführung bestimmter RNA-Stücke gehemmt werden (Gene Silencing). Damit soll das Gleichgewicht in Richtung gezielter Integration verschoben werden.

Das Verfahren soll für verschiedene Pflanzenarten anwendbar sein. Es wird jedoch zunächst für Tabak und Arabidopsis entwickelt.

Ergebnisse

zu 1. Durch ein Testsystem konnte eindrucksvoll die Verwendbarkeit des selten schneidenden Restriktionsenzym I-SceI zur gezielten Veränderung des Pflanzengenoms demonstriert werden. Es konnte dabei eine neuartige Technik zur Eliminierung von Transgensequenzen aus dem Pflanzengenom etabliert werden. Die Verwendung von Schnittstellen des Enzyms I-SceI im Transgenkonstrukt vor und nach dem Markergen ermöglicht es nach Expression von I-SceI in der Pflanze Doppelstrangbrüche beidseitig des Markergens zu induzieren. Dadurch kann das Markergen entfernt werden. (siehe Abbildung)

zu 2. Sequenzen von mehreren Proteinen, die an der illegitimen Rekombination beteiligt sind, konnten aus Tabak isoliert werden. Es wurden transgene Pflanzen hergestellt, bei denen die Funktion dieser Proteine unterbunden wurde.

Allerdings konnte auf diese Weise der gezielte Einbau neuer DNA-Sequenzen an bestimmten Stellen im Genom nicht zusätzlich unterstützt werden, was darauf hindeutet, dass weitere noch unbekannte Faktoren an der illegitimen Rekombination in Pflanzen beteiligt sind. Deshalb müssen zukünftige Ansätze zur Etablierung der Technik in Pflanzen neue Wege gehen. Hierzu wird es ein Folgeprojekt geben.