04.06.2003

Forschung Projekte

Untersuchungen zur gentechnischen Optimierung von Rhizobien

(1991 – 1991) Zentrum für Agrarlandschafts- und Landnutzungsforschung (ZALF); Müncheberg

Thema

Bestimmte Knöllchenbakterien (Rhizobium meliloti) leben in Symbiose mit Luzerne. Sie fixieren den Stickstoff aus der Luft und wandeln ihn in eine für die Pflanzen verwertbare Form um.

Das Ziel dieses Forschungsprojekts bestand darin, Rhizobium meliloti-Stämme mit effektiverer Stickstoff-Fixierung zu entwickeln. Es ist bekannt, dass ein effektives Wasserstoff-Recycling-System in der Symbiose zwischen Luzerne und R. meliloti vorteilhaft für die Stickstoff-Fixierung ist.

Daher stellte sich folgende Frage:

• Gibt es Gene von R. meliloti, die eine hohe Aufnahme-Hydrogenase-Aktivität und damit eine effektive Wasserstoff-Aufnahme bewirken?

Zusammenfassung

Im Genom von R. meliloti wurde eine DNA-Region gefunden, die eine Wasserstoff-Aufnahme (Hydrogenase-Aktivität) in E.coli bewirkt und in anderen R. meliloti-Stämmen erhöhen kann. In der Region wurden sieben Gene gefunden, wovon drei Gene als Urease-Strukturgene (harnstoffabbauendes Enzym) identifiziert wurden. Ein oder mehrere Gene beeinflussen sowohl die Urease- als auch die Hydrogenase-Aktivität.

Versuchsbeschreibung

Identifizierung von Genen. Um Gene zu finden, die eine hohe Aufnahme-Hydrogenase-Aktivität bewirken, wurde von einem R.meliloti- Wildstamm eine so genannte Genbank erstellt: Es wurden solche DNA-Fragmente selektiert, die in E. coli zu einer Aufnahme-Hydrogenase-Aktivität führen und nach Übertragung in andere R. meliloti-Stämme deren Hydrogenase-Aktivität erhöhen. Eines dieser Fragmente wurde näher analysiert.

Erzeugung von Mutationen. Von der DNA-Region wurden Mutanten mit Hilfe eines Transposons hergestellt. Die Konstrukte wurden in R. meliloti übertragen und auf eine veränderte Urease- und Hydrogenase-Aktivität untersucht.

Nachweis der Expression der Urease-Gene in R. meliloti. Um die Funktion einzelner Gene in dem Bereich zu untersuchen, wurde in jedes Gen eine „Kassette“ integriert. In dieser Kassette sitzt hinter einem Antibiotikaresistenz-Gen ein Promotor, der die jeweils nachfolgenden Gene anschalten kann.

Ergebnisse

Im Genom von R. meliloti wurde eine DNA-Region gefunden, die die Steuerung der Wasserstoff-Aufnahme (Hydrogenase-Aktivität) beeinflusst. Diese Region wurde vollständig sequenziert. Es konnten drei Urease-Gene identifiziert werden. Die Funktion der weiteren Gene in diesem Bereich ist noch unbekannt.

Sowohl eine Mutante, bei der das Transposon in einem Urease-Gen saß, als auch eine, der die gesamte Urease-Region fehlte, zeigten keine Urease- und reduzierte Hydrogenase-Aktivität. Damit beeinflussen ein oder mehrere Gene sowohl die Urease-, als auch die Hydrogenase-Aktivität.

Es wurden insgesamt sieben Gene gefunden, von denen drei Gene als Urease-Gene identifiziert wurden. Es besteht eine starke Ähnlichkeit (Homologie) zwischen diesen Urease-Genen und den entsprechenden Genen anderer Mikroorganismen und einer Leguminose (Jack bean). Allerdings scheint die Organisation der Urease-Gene vollkommen anders zu sein als die der bisher beschriebenen bakteriellen Ureasen. Zwischen den Strukturgenen befinden sich Gene mit noch unbekannter Funktion.