04.06.2009

Forschung Projekte

Erzeugung Markergen-freier Rapspflanzen durch Nutzung des Cre/lox-Systems

(2005 – 2008) Universität Rostock, Agrar- u. Umweltwissenschaftliche Fakultät, Institut für Landnutzung (ILN)

Thema

Mit Hilfe von Rekombinationssystemen können Markergene aus transgenen Pflanzen herausgeschnitten werden. Am Beispiel des Tabaks wurde in einem vorangegangenen Forschungsprojekt erfolgreich das transiente Cre/lox-System angewendet. Dabei schneidet das Enzym Cre-Rekombinase das Markergen aus dem Pflanzengenom heraus. Transient bedeutet, dass dieses Enzym nur in einem bestimmten Zeitraum in der Pflanze aktiv ist (transiente Expression).

Das Cre/lox-System sollte in diesem Teilprojekt auf Rapspflanzen und in einem zweiten Teilprojekt auf Reben übertragen und optimiert werden. Ein weiteres Ziel des Projektes war es, das Rekombinationssystem mit wirtschaftlich relevanten Genen zu verknüpfen. In diesem Projekt wurde dazu das Stilbensynthase-Gen verwendet. Es exprimiert Resveratrol, eine Verbindung, die gegen Pilze wirkt.

Zusammenfassung

Ziel dieses Projektes war es, Markergene mit einem vorübergehend wirkenden Rekombinationssystem (Cre/loxP) aus Raps zu entfernen. Die Eliminierung sollte zum einen durch eine Virusinfektion der Rapspflanzen, zum anderen durch die Verwendung eines samenspezifischen Promotors erreicht werden. Die durchgeführten Arbeiten zeigen:

• Das Cre/loxP-Rekombinationssystem konnte in Raps erfolgreich zur Markergen-Eliminierung eingesetzt werden.
• In Verbindung mit einem Virusvektor eignet sich das Cre/loxP-System nicht zur Markergeneliminierung in Raps.
• In Verbindung mit einem samenspezifischen Promotor hat das Cre/loxP-System sowohl in der Modellpflanze Tabak als auch in der Kulturpflanze Raps funktioniert. Die Nachkommenschaft dieser transgenen Pflanzen enthielt kein Markergen mehr.
• Die samenspezifische Markergen-Eliminierung kann nun auf andere Kulturarten übertragen werden.

Versuchsbeschreibung

Das Markergen wird zwischen zwei Erkennungssequenzen, den lox-Sites, in Raps transformiert. Die Cre-Rekombinase erkennt später diese lox-Sites und schneidet das Markergen heraus. Dieser Vorgang soll in der Pflanze zeitlich begrenzt stattfinden. Dafür kommen zwei Strategien zum Einsatz:

• (1) Zum einen wird ein Virusvektor (Tabak Mosaik Virus) hergestellt, der das Cre-Rekominase-Gen besitzt. Das Gen ist nur so lange in der Zelle aktiv, so lange diese von dem Virus befallen ist.
• (2) Im zweiten Ansatz wird vor das Cre-Rekombinase-Gen ein samenspezifischer Promotor gesetzt. Damit wird die Cre-Rekombinase nur in den Samen exprimiert.

Aktivierung des Cre/lox-Systems. Im ersten Ansatz werden die transgenen Rapspflanzen mit dem Tabak Mosaik Virus infiziert. In den infizierten Zellen ist die Cre-Rekombinase aktiv und schneidet das Markergen heraus. Anschließend werden die Zellen auf Ribavirin-haltigen Medien regeneriert. Ribavirin unterbindet das Viruswachstum.

Im zweiten Ansatz werden von den transgenen Pflanzen Nachkommen aus Selbstbestäubung gewonnen. Hier ist die Cre-Rekombinase nur in den Samen aktiv.

Analyse der regenerierten Pflanzen. Die regenerierten Rapspflanzen sowie die Nachkommen aus Selbstbestäubung werden auf Markergen-Eliminierung und die regenerierten Pflanzen zudem auf Virus-Freiheit getestet.

Ergebnisse

Das Projekt hat Mitte 2005 begonnen. Im den ersten beiden Projektjahren wurden das lox-Konstrukt und der Virusvektor aufgebaut und mittels Agrobakterien in Rapspflanzen transformiert.

(1) Virus-vermittelte Markergen-Eliminierung

Das System für die Virus-vermittelte Markergen-Eliminierung besteht aus zwei Komponenten: einem TMV-Cre-Virusvektor und lox-transgenen Pflanzen.

Herstellung der lox-transgenen Pflanzen. Das Konstrukt für die Pflanzentransformation besteht aus 35S-Promotor, bar-Herbizidresistenz-Gen und gfp-Gen (Reportergen). Mit diesem Konstrukt soll geprüft werden, ob die gewählte Strategie grundsätzlich funktioniert. Das bar-Gen steht für das zu eleminierende Markergen, das gfp-Reportergen für ein wirtschaftlich interessantes Gen. In den transgenen Pflanzen wurde mittels PCR-Analyse nachgewiesen, ob Marker- und Reportergen tatsächlich integriert sind. Die lox-Schnittstelle ist damit in den Pflanzen vorhanden.

Virusvektor. Die andere Komponente im Cre/lox-Rekombinationssystem ist der Virusvektor. Mit diesem Vektor ließen sich jedoch nur 70 Prozent der Rapspflanzen infizieren. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde der Vektor im darauf folgenden Jahr (2006) modifiziert. Anschließend erfolgte die Infektion der Nachkommen der lox-Pflanzen mit dem angepassten Virusvektor. Auch dieser Vektor zeigte nur geringe Infektionsraten und eignet sich daher nicht für eine Expression des Cre-Rekombinase-Gens in Rapspflanzen.

(2) Markergen-Eliminierung über einen samenspezifischen Promotor

Für die Eliminierung des Markergens mit Hilfe eines samenspezifischen Promotors gab es zwei verschiedene Versuchsansätze.

Für den ersten Ansatz wurde ein Vektor hergestellt, der lox-Sequenzen, Cre-Gen, Markergen, Promotor und das wirtschaftlich interessante Gen für die Stilbensynthase in einem Transformationsschritt in die Pflanze einbringt. Dabei liegt das Cre-Gen zusammen mit dem Markergen innerhalb der beiden lox-Sites. Das Herausschneiden dieser Sequenz bringt den Promotor in die Nähe des Stilbensynthase-Gens und führt zu einer samenspezifischen Expression des Resveratrols.

Der Transformationsvektor wurde mittels Agrobakterien in die Rapspflanzen eingebracht. Durch Southern Blot-Analyse konnten sieben transgene Linien ermittelt werden. Sie wurden in Erde herangezogen und anschließend durch Selbstbestäubung vermehrt. Die Nachkommen dieser Pflanzen wurden dann auf Rekombinationsereignisse hin untersucht. Dazu wurden die Samen mit einem Herbizid behandelt und ihr Keimverhalten beobachtet. Dabei zeigte die Mehrheit der untersuchten Linien nach drei Wochen eine Empfindlichkeit gegen das Herbizid. Anschließend durchgeführte molekularbiologische Untersuchungen (PCR) bestätigten dieses Ergebnis: in den meisten Linien war die Rekombination erfolgreich, d.h. sie enthielten kein Marker-Gen mehr.

In einem zweiten Ansatz wurden die Pflanzen mit zwei verschiedenen Vektoren cotransformiert. Ein Vektor enthält das von lox-Sequenzen flankierte Markergen und das Stilbensynthase-Gen. Der andere Vektor ist aus dem cre-Gen, das unter der Kontrolle eines samenspezifischen Promotors steht, und dem gus-Reportergen aufgebaut. Die Vektoren wurden in zwei verschiedene Agrobakterienstämme übertragen und zunächst in Tabakpflanzen als Testsystem transformiert. 70 Prozent der mittels PCR untersuchten Linien enthielten Cre-Rekombinase und lox-Konstrukt. Diese positiv getesteten Linien wurden durch Selbstbestäubung vermehrt. Die Samen der ersten Nachkommenschaft wurden mit einem Herbizid behandelt und deren Keimungsverhalten beobachtet. Bei acht der zehn untersuchten Linien zeigten alle Pflanzen eine Empfindlichkeit gegen das Herbizid, d. h. sie enthielten kein Marker-Gen mehr. Molekularbiologische Untersuchungen (PCR und Southern Blot) bestätigten diese Ergebnisse.

Die in diesem Ansatz verwendeten Vektoren wurden dann in Rapspflanzen eingebracht und anschließend mittels PCR auf das Vorhandensein der eingebrachten Gensequenzen überprüft. Dabei zeigte sich bei allen untersuchten Pflanzen, dass der Vektor mit dem Cre-Gen nicht in das Rapsgenom integriert wurde. Eine Markergen-Eliminierung über Cotransformation ist daher nicht für Raps geeignet.