Cas9 – ein molekularbiologisches Mikroskalpell

Wissenschaftler haben ein Abwehrsystem aus Bakterien zu einem molekularbiologischen Präzisionsinstrument umfunktioniert. Damit lässt sich das Genom höherer Lebewesen relativ unkompliziert, aber dennoch sehr gezielt umschreiben. Das Cas-System könnte die Gentechnik revolutionieren.

Die Weltbevölkerung wächst stetig und mit ihr der Bedarf an Nahrungsmitteln. „Um diesen Bedarf in Zukunft decken zu können, benötigen wir ertragreiche Pflanzen, die mit wenigen Supplementen auf geringer Fläche nachhaltig angebaut werden können“, schreibt ein Team aus Wissenschaftlern um Prof. Dr. Detlef Weigel vom Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie in Tübingen in der aktuellen Ausgabe von Nature Biotechnology. Doch ein Pflanzengenom präzise und kontrolliert umzuschreiben, ist nach wie vor ein schwieriges Unterfangen. Mit den üblichen gentechnischen Methoden, wie beispielsweise mit Hilfe von Transposons, lassen sich neue Gene zwar mittlerweile einfach in ein Pflanzengenom einbauen. Wo das neue Gen integriert wird, bleibt jedoch eher dem Zufall überlassen. Das kann zu unerwünschten Nebeneffekten führen, die Wissenschaftler als Positionseffekte bezeichnen. Denn der Integrationsort im Genom beeinflusst auch, wie stark und wie dauerhaft ein Gen abgelesen wird, oder ob es womöglich erst gar nicht aktiv wird. Außerdem können auch andere Gene durch das neu integrierte Gen in ihrer Funktion beeinträchtigt werden.

Präzise, aber zeitaufwendig

In den letzten Jahren haben sowohl der Einsatz von Zinkfingernukleasen (ZFN) als auch von sog. TALENs (transcription activator-like effector nucleases) die Molekularbiologie regelrecht revolutioniert. Mit beiden lassen sich zelluläre Gene durch neue, veränderte Kopien ersetzen, in die beispielsweise Mutationen oder neue Genabschnitte eingebaut wurden. Trotz aller Präzision, mit der sich mit Hilfe dieser Methoden gezielt Veränderungen im Genom erzeugen lassen, sind sie nicht ohne Schwächen. Denn beide Technologien sind aufwendig und zeitraubend, da die Proteine für jede individuelle DNA-Bindungsstelle erst konstruiert und dann im Labor hergestellt werden müssen.

Das Cas-System – ein molekularbiologisches Präzisionsskalpell

Letztes Jahr veröffentlichten Wissenschaftler eine weitere, effiziente Methode, mit der sich Genome gezielt modifizieren lassen. Sie basiert auf einem Protein, mit dem sich Bakterien gegen Angriffe fremder Organismen verteidigen. Dieses adaptive bakterielle Abwehrsystem haben Wissenschaftler nun zu einem molekularbiologischen Präzisionsskalpell für eukaryotische Zellen umfunktioniert. Dr. Rebecca Schwab vom Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie in Tübingen erklärt: „Cas9 ist ein bakterielles Protein (isoliert zum Beispiel aus Streptococcus pyogenes) und Teil des sogenannten CRISPR/Cas Systems, ein adaptives Immunsystem in Bakterien, das invasive DNA-Moleküle, z.B. aus einem Bakteriophagen, gezielt zerschneiden kann. Nach erstmaliger Begegnung mit der invasiven DNA werden kurze Segmente in die sogenannten CRISPR-Loci (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) im bakteriellen Genom integriert. Von dort können sie abgelesen und in RNA-Moleküle übersetzt werden. Diese RNA-Moleküle binden gezielt an das Cas9-Protein und dirigieren dieses zu homologen DNA-Molekülen. Nach erneuter Invasion der fremden DNA kann diese nun gezielt zerschnitten und unterdrückt werden.“

Das Cas9-Protein kann auch in eukaryotischen Zellen DNA-Doppelstrangbrüche induzieren, um dort neue Gene einzubauen. Hierzu müssen sowohl Cas9 als auch die zugehörige Guide-RNA (gRNA) in die jeweiligen Zellen eingebracht und dort exprimiert werden. Die gRNA kann hierbei so modifiziert werden, dass eine gewünschte Sequenz im Genom erkannt und von Cas9 geschnitten wird. So kann das Cas9-System vielfältig eingesetzt werden.

Ausschalten von Genen durch Einfügen kleiner Mutationen

„In Eukaryoten werden Doppelstrangbrüche in der DNA in der Regel ungenau repariert, was meist zum Löschen von wenigen Basen um die ursprüngliche Schnittstelle führt. Erfolgt dies in einer Protein-kodierenden Sequenz, führt dies oft zu einer Verschiebung des Leserasters und somit zu einem Verlust der Protein-Funktion. Diese gezielte Induktion von Mutationen wurde mittlerweile in einer Vielzahl von tierischen und pflanzlichen Systemen erfolgreich durchgeführt. Auch wurden schon simultan mehrere Mutationen induziert, was ermöglicht, dass Doppelmutanten in einem Schritt generiert werden können und genetische Kreuzung von Einzelmutanten nicht mehr nötig sind“, beschreibt Dr. Schwab eine der molekularbiologischen Möglichkeiten, ein Genom gezielt zu verändern.

„Löschung“ von Genen

Zusätzlich zum Ausschalten von Genen durch Einführung kleiner Mutationen können Gene mittels der Cas9-Technologie auch komplett gelöscht werden. Das kann z.B. sinnvoll sein, wenn die Funktion eines Gens geklärt werden soll. Dann werden die Auswirkungen des fehlenden Gens auf die Zelle untersucht. Dr. Schwab erklärt: „Hierzu werden Doppelstrangbrüche an beiden Enden der Gen-Sequenz induziert. Der Reparatur-Prozess vereinigt dann die noch intakten Chromosomen-Arme, das kleine Zwischenstück geht verloren.“

Einbau neuer Sequenzen

Über homologe Rekombination können in der unmittelbaren Umgebung der Cas9-induzierten DNA-Schnittstelle neue, fremde DNA-Anschnitte ins Genom eingebaut werden. „Aus tierischen Systemen ist bekannt, dass DNA-Doppelstrangbrüche die Effizienz der homologen Rekombination in der nahen Umgebung erhöhen kann. Wie auch mittels Zinkfinger-Nukleasen kann dies ausgenutzt werden, um fremde Sequenzen an der durch Cas9-induzierten Schnittstelle einzubauen. Dies wurde auch in Pflanzen schon erfolgreich durchgeführt“, so Dr. Schwab.

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Rekrutieren anderer Proteine

Desweiteren kann die sequenzspezifische DNA-Bindung des Cas9-Proteins auch genutzt werden, um weitere Proteine zu diesem Ort in Genom zu rekrutieren, indem sie physisch an Cas9 gekoppelt werden. Hierbei werden Varianten von Cas9 benutzt, welche ihre katalytische Aktivität verloren haben, so dass Doppelstrangbrüche nicht mehr erfolgen. „Mittels dieser Strategie wurde in humanen Zellen ein transkriptionelles Repressor-Proteine an die regulatorische Sequenz eines gewünschten Gens rekrutiert und die Gen-Aktivität robust unterdrückt“, erkärt Dr. Schwab den Effekt dieses Ansatzes.

Vorteile des Cas9 Systems

Wie auch Zinkfinger-Nukleasen und TALENs verursacht Cas9 Brüche in der DNA. Sämtliche Anwendungen von Cas9-Induktion von Mutationen, Gen-Deletionen, Effizienz-Steigerung von homologer Rekombination in der unmittelbaren Umgebung, Rekrutierung von weiteren Chromatin-modifizierenden Proteinen - wurden auch bereits mit Zinkfinger-Nukleasen und TALENs erfolgreich durchgeführt. Worin liegt dann das Revolutionäre an der Cas9-Methode?

“Das Cas9-System lässt sich viel einfacher und schneller konstruieren. Denn anders als bei ZFN und TALENs beruht seine Spezifität nicht auf dem Protein, sondern auf der Sequenz einer kurzen gRNA. Für jede neue Zielsequenz im Genom muss lediglich eine kurze Sequenz von 20 Basenpaaren (bp) der gRNA neu konstruiert werden. Das Cas9 Protein kann unverändert immer wieder benutzt werden“, erklärt Dr. Sophien Kamoun, Leiter des Sainsbury Laboratory im Norwich Research Park, in Großbritannien. „Da das Cas9-System einfach aufgebaut ist, können Mutationen, Insertionen und Deletionen schneller und in größerer Anzahl getestet werden. Außerdem können mehrere Gene auf einmal ausgeschaltet werden“, ergänzt Dr. Schwab. Neben der kurzen Vorbereitungszeit liegt ein weiterer großer Vorteil der sgRNA:Cas9 Methode darin, dass sie nicht auf Marker-Gene wie beispielsweise antibiotische Selektionsmarker angewiesen ist. Ihre außerordentliche Präzision konnten Wissenschaftler bereits in zahlreichen höheren Organismen wie auch in verschiedenen Pflanzenarten unter Beweis stellen.

Bedeutung für die Pflanzenforschung und –zucht

Wissenschaftler gehen davon aus, dass dieses genetische Mikro-Skalpell bald in Forschungslaboren und evtl. auch bei Pflanzenzüchtern rund um den Globus etablieren wird, wenn es darum geht, das Genom eines höheren Organismus gezielt und präzise zu verändern. In einem Punkt sieht Dr. Schwab aber noch Nachbesserungsbedarf: „Die Frequenz, mit der die Cas9-induzierten Mutationen zu beobachten sind, bewegen sich oft noch im unteren zweistelligen oder sogar einstelligen Prozent-Bereich, jedoch konnten teilweise schon über 30% gemessen werden. Nichtsdestotrotz bedeutet das, dass biallelische Mutationen, das sind Mutationen in beiden Chromosomen-Armen, noch immer selten direkt erreicht werden, also eine weitere Generation nötig ist, um homozygote Mutanten zu generieren.“ 

Trotz dieser kleinen Schwäche der Methode ist die Cas9-Methode für Dr. Kamoun eine molekularbiologische Revolution: „Mit dieser Methode lassen sich unzählige neue Allele generieren, von denen viele auch für die Pflanzenzucht extrem nützlich sein werden, denn damit stehen Züchtern grenzenlose genetische Variationen zur Verfügung.“