Der Mikrobiota-Schnelltest

Neues Protokoll zur Kultivierung von Bakterien im Wurzelraum

26.02.2021 | von Redaktion Pflanzenforschung.de

Die Mikrobiota im Wurzelraum von Pflanzen (hier: Gerste) lassen sich jetzt schneller und einfacher bestimmen. (Bildquelle: © Stefan Werner / Pixabay / CC0)

Die Mikrobiota im Wurzelraum von Pflanzen (hier: Gerste) lassen sich jetzt schneller und einfacher bestimmen. (Bildquelle: © Stefan Werner / Pixabay / CC0)

Die Interaktion von Pflanzen und Mikroorganismen ist von großer Bedeutung für die Landwirtschaft, jedoch je nach Kultur und Standort unterschiedlich. Mit einem neuen Protokoll lässt sich jetzt schneller und einfacher bestimmen, wie sich die jeweiligen Mikrobiota zusammensetzen.

Mikroorganismen im pflanzlichen Wurzelraum beeinflussen zahlreiche physiologische Eigenschaften. Heute geht man sicher davon aus, dass diese Mikrobengemeinschaft, die sogenannte Mikrobiota, Pflanzen in einer Stresssituation vor Krankheiten, Hitze, Nährstoffmangel oder Schädlingsbefall schützen können. Und es ist bekannt, dass Pflanzen durch Wurzelabsonderungen darauf Einfluss nehmen, wie sich die mikrobielle Gemeinschaft in ihrem Wurzelraum zusammensetzt.

Wie diese Interaktionen jedoch im Einzelfall für die jeweilige Kulturpflanzensorte – auch je nach Standort und Anbaubedingungen – aussieht, ist Gegenstand unzähliger Forschungsvorhaben. Ein neues Protokoll zur Kultivierung der Wurzelmikrobiota soll nun helfen, diese Arbeiten zu vereinfachen und zu beschleunigen.

Drei Probleme

Möchte eine Forschungsgruppe die wurzelassoziierten Mikroorganismen identifizieren, müssen sie zunächst isoliert und im Labor kultiviert werden. Doch dabei warten drei Herausforderungen auf die WissenschaftlerInnnen:

  • Die Mikroorganismen haben unterschiedliche Wachstumsgeschwindigkeiten. Schnell wachsende Stämme behindern meist das Wachstum langsamerer Stämme. In den Laborkulturen könnten letztere daher oft unterrepräsentiert sein.
  • Zweitens benötigt die etablierte Sequenzierungsmethode nach Sanger DNA-Proben einer klonalen Kultur und liefert unbrauchbare Ergebnisse, sollte die Proben-DNA von genetisch unterschiedlichen Mikroorganismen stammen. Um das zu verhindern, müssen die Kulturen vor der DNA-Extraktion zeitaufwändig im Labor vereinzelt werden.
  • Drittens entstehen bei der Analyse der Mikrobiota sehr große genetische Datenmengen, die erfasst, verarbeitet und ausgewertet werden müssen.
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Pflanzen sind mit vielen Mikroorganismen vergesellschaftet. Bodenbakterien machen jedoch den größten Teil aus. Möchte man diese Bakterien im Labor kultivieren, gibt es einige Herausforderungen.

Pflanzen sind mit vielen Mikroorganismen vergesellschaftet. Bodenbakterien machen jedoch den größten Teil aus. Möchte man diese Bakterien im Labor kultivieren, gibt es einige Herausforderungen.

Bildquelle: © iStock.com/megaflopp

Drei Lösungen

Ein internationales Forschungsteam unter Beteiligung des Kölner Max-Planck-Instituts für Pflanzenzüchtungsforschung hat für diese experimentellen Hürden nun praktikable Lösungen präsentiert. Diese könne so ziemlich jede Arbeitsgruppe mit ihren vorhandenen Möglichkeiten innerhalb von acht bis neun Wochen umsetzen – ohne spezielle bioinformatische Kompetenzen. Limitiert ist der Ansatz jedoch auf das Reich der Bakterien.

Zunächst werden die Proben von frischen Wurzeln entnommen, die in natürlicher Erde gewachsen sind. Die Wurzelmikrobiota muss zu diesem Zeitpunkt schon voll entwickelt sein, beispielsweise bei der Ackerschmalwand nach sechs Wochen oder bei Reis nach acht Wochen.

Tage statt Wochen

Das Problem unterschiedlich schnell wachsender Kulturen kann umgangen werden, wenn die Mikroorganismen geschickt verdünnt und in Flüssigmedien in 96-Loch-Kulturplatten kultiviert werden. Wenn die Verdünnung so gewählt ist, dass in ca. 30 Prozent der Löcher erkennbar Kulturen anwachsen, ist bei einer angenommenen Poisson-Verteilung die Wahrscheinlichkeit besonders hoch, dass es sich dabei fast immer um klonale Kulturen handelt. Optimal sei eine Verdünnung, die je Milliliter zwei kultivierbare Bakterien enthalte.

Zudem empfehlen die ForscherInnen ein zehnfach verdünntes Nährmedium aus tryptischer Sojabrühe, um schnell wachsende Bakterien auszubremsen. Auf diese Weise sind weder teure Geräte wie zur Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung erforderlich, noch das zeitaufwändige händische Vereinzeln der Kolonien. Statt wochenlanger Vereinzelung könne dieser Schritt in ein bis zwei Tage abgeschlossen sein.

70 Prozent erfolgreich kultiviert

Für die taxonomische Bestimmung der Bakterien nutzte das Team zunächst eine Analyse der 16S-rRNA-Gensequenzen mit der Methode der 454-Pyrosequenzierung und mit einem einseitigen Barcode-System. Inzwischen empfehlen die WissenschaftlerInnen jedoch ein zweiseitiges Barcode-System, das Platte und Loch in einem Schritt identifiziert, und die Illumina-Technologie für die Sequenzierung der rRNA. So könne eine noch größere Tiefe und Genauigkeit der Sequenzierung erzielt werden. Mit diesem Ansatz gelang es dem Team, rund 70 Prozent aller bakteriellen Taxa aus dem Wurzelraum von Reispflanzen für die weitere Bestimmung zu kultivieren. Details zum Sequenzierungsprotokoll hat die Gruppe im Fachjournal „Nature Protocols“ veröffentlicht.

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Das Problem unterschiedlich schnell wachsender Kulturen kann umgangen werden, wenn die Mikroorganismen geschickt verdünnt und in Flüssigmedien in 96-Loch-Kulturplatten kultiviert werden.

Das Problem unterschiedlich schnell wachsender Kulturen kann umgangen werden, wenn die Mikroorganismen geschickt verdünnt und in Flüssigmedien in 96-Loch-Kulturplatten kultiviert werden.

Bildquelle: © iStock.com/sergunt

Um die gewonnenen genetischen Daten auszuwerten, entwickelten die Fachleute einen bioinformatischen Prozess namens „Culturome“. Das Programm kann auf lokalen Rechnern ausgeführt werden oder nutzt alternativ eine online-basierte grafische Nutzerschnittstelle. Dabei griff das Team für vorhandenen Sequenzanalyse-Protokolle wie QIIME, USEARCH, VSEARCH sowie eigene Skripte zurück.

Forschung, Züchtung und Landwirtschaft profitieren

Die Vorteile dieses vereinfachten und schnellen Standardverfahrens liegen auf der Hand: Sind die beteiligten Stämme im Wurzelraum einer Pflanzenart erst einmal bestimmt, können deren Funktionen und Interaktionen mit den Pflanzen leichter studiert werden. Auch lassen sich so bestimmte Stämme kombinieren oder ausschließen und die Effekte unterschiedlicher Umweltbedingungen vergleichen. Neben dem rein wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn für die Pflanzenzüchtung gibt es schon konkrete Anwendungsideen für die Landwirtschaft: eine prophylaktische Impfung des Saatguts mit förderlichen Bakterien, die die jungen Pflanzen gegen Umweltstress unempfindlicher machen.

Erprobt ist die Methode zwar nur für Bakterienproben aus dem Wurzelraum, doch sie sollte sich auch auf andere Mikrobiota übertragen lassen, schreibt das Erfinderteam – etwa das von Blättern, Samen, Böden oder von Nahrungsmitteln. Für Bakterien, die nicht in Flüssigmedien wachsen oder strikt anaerob leben, sei dieses Protokoll jedoch ungeeignet.


Quelle:
Zhang, J. et al. (2021): High-throughput cultivation and identification of bacteria from the plant root microbiota. In: Nature Protocols, Vol. 16, 988-1012, (16. Februar 2021), doi: 10.1038/s41596-020-00444-7.

Weiterführende Informationen:

Zum Weiterlesen auf Pflanzenforschung.de:

Titelbild: Die Mikrobiota im Wurzelraum von Pflanzen (hier: Gerste) lassen sich jetzt schneller und einfacher bestimmen. (Bildquelle: © Stefan Werner / Pixabay / CC0)