CROPS OF THE FUTURE

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DNA- und Gewebekultur-freie Genomeditierung

Koordinator: Dr. habil. Michael Wassenegger – RLP AgroScience GmbH

Projektbeschreibung

Das “clustered regularly interspaced short palindromic repeat” (CRISPR) -assoziierte Protein 9 (Cas9) -Genom-Editiersystem (CRISPR / Cas9) wurde aus dem prokaryotischen Typ-II-adaptiven Immunitätssystem abgeleitet. Diese bahnbrechende Technologie wurde in Pflanzen weitverbreitet eingesetzt, um Genommodifikationen zur Verbesserung von Pflanzeneigenschaften zu erzielen. In den meisten Fällen wurden CRISPR / Cas9-DNA-Konstrukte verwendet, die durch Agrobacterium tumefaciens-vermittelten T-DNA-Transfer oder biolistischen Partikelbeschuss
in Pflanzen eingebracht wurden. Während dieses Prozesses ist es jedoch sehr wahrscheinlich, dass CRISPR / Cas9-Konstrukte in das Genom integrieren. Daher wurden DNA-freie Methoden zur Genom-Editierung entwickelt, die eine
Protoplasten-Transfektion mit Cas9 / sgRNA-Ribonukleoprotein-Komplexen verwenden. Der Protoplastenansatz setzt jedoch umfangreiche Gewebekulturarbeiten für die Regeneration von Pflanzen voraus, die oft die gewünschten Mutationen zusammen mit unerwünschten Ereignissen von somaklonaler Variation tragen.

In diesem Vorhaben verfolgen wir das Ziel, ein DNA-freies Genom-Editierverfahren zu entwickeln, das auch ohne Gewebekultur funktioniert. Wir haben bereits eine Hochdrucksprühmethode entwickelt, um RNA-Moleküle effizient in Pflanzenblätter und meristematisches Gewebe einzuführen (Dalakouras et al., 2016). Mit dieser Technik wollen wir Cas9 / sgRNAs entweder als Ribonukleoprotein-Komplexe oder als reine RNA-Mischung in das apikale Sprossmeristem (SAM) einer grün fluoreszierenden Protein (GFP) -exprimierenden Tomatenpflanze einbringen.
Bisher wurde der Transport des Cas9-Proteins durch Einfügen von Kernlokalisierungssignale (NLS) in die Cas9-codierende Region in den Kern eukaryotischer Zellen gewährleistet. In unserem innovativen Ansatz werden wir
zusätzlich RNA-Motive verwenden, die den Transport von sgRNAs in den Zellkern erleichtern. Darüber hinaus werden wir Lipid-Doppelhydroxid (LDH)-Nanoschichten verwenden, um den Cas9 / sgRNA-Komplex zu stabilisieren und
seine Aufnahme durch Pflanzenzellen zu verbessern. Beim Hochdrucksprühen wird das Genom-Editieren (hier das Editieren des GFP-Transgens) u.a. auch in SAM-Zellen stattfinden. Einige der sich aus dem SAM entwickelnden Blätter und Seitenzweige werden die gewünschten Mutationen tragen, was sich durch die Inaktivierung der GFP-Expression unter UV-Licht verfolgen lässt. Nach Selbstbestäubung der Blüten an mutierten Zweigen sollten Samen produziert werden, die die Mutation tragen. Somit werden in der nächsten Generation auch einige der Nachkommen die gewünschte Mutation stabil tragen. Die hier vorgeschlagene Methode könnte für die Pflanzenzüchtung von großer Bedeutung sein. Es ist vorstellbar, dass das DNA- und Gewebekultur-freie Genomeditieren den Weg für die Mutagenese von schwer regenerierbare Pflanzensorten und wahrscheinlich auch von Holzpflanzen ebnen wird.

(english (Beta))

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DNA-free and tissue culture-free genome editing

Projektbeschreibung (en)

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) genome editing system (CRISPR/Cas9) is adapted from the prokaryotic type II adaptive immunity system. This breakthrough technology has been widely used in plants to introduce genome modifications and is paving the way for precision crop trait improvement. In most of the cases, CRISPR/Cas9 DNA constructs have been used, delivered into plants by Agrobacterium tumefaciens-mediated T-DNA transfer or biolistic particle bombardment. However, during this process there is high probability that CRISPR/Cas9 constructs are integrated in the genome.
Thus, DNA-free methods for genome editing have been developed, employing protoplast transfection with Cas9/sgRNA ribonucleoprotein complexes. However, the protoplast approach presupposes extensive tissue culture for the regeneration of plants carrying the desired mutations with the risk of undesired onset of somaclonal variation. In this proposal, we aim to develop a DNA-free genome editing method that is also tissue-culture-free. We have previously developed a method for efficient delivery of RNA molecules into plant leaves and meristematic tissues through high pressure spraying (Dalakouras et al., 2016). Using this assay, we aim to introduce Cas9/sgRNAs either as DNA-ribonucleoprotein complexes or as mere RNA mixture specifically into the shoot apical meristem (SAM) of a Green Fluorescent Protein (GFP)-expressing tomato plant. So far, care has been taken to target Cas9 protein into the nucleus of eukaryotic cells, fusing nuclear localization signals (NLS) to Cas9 coding regions. In our innovative approach we will in addition use RNA motifs facilitating the transport of sgRNAs into the nucleus.
Moreover, we will use lipid double hydroxide (LDH) nanosheets to stabilize the Cas9/sgRNA complex and facilitate its delivery into the plant cell. Upon high pressure spraying, genome (GFP) editing will likely take place in SAM cells.
The newly emerged leaves and branches thereof will contain the mutation, as can be visualized by the inhibition of GFP expression under UV-light examination. Finally, self pollination of the flowers on the mutated branches are expected to produce seeds containing the mutation. Thus, in the next generation, some of the plants will stably carry the desired mutation. This proposed method of genome editing will likely have great impact on the development of plant biotechnology and breeding sector. One may envisage that the successful outcome of this proposal will pave the way for the DNA-free and tissue-culture free genome editing for crop cultivars that are difficult to be regenerate and probably also for woody plants which have long reproductive cycles and are cumbersome for regeneration by tissue culture.

Eckdaten

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Projektlaufzeit

01.06.2018 - 31.05.2020

Förderkennzeichen

031B0531

Fördersumme

Öffentlich: 218.272,00 €
Privat: 0,00 €
Gesamt: 218.272,00 €
Herr Dr. habil Michael Wassenegger
E-Mail-Kontakt
RLP AgroScience GmbH
Institute für Pflanzenforschung

Breitenweg 71
67435 Neustadt/W.
Deutschland
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