CROPS OF THE FUTURE

ProTAL

Stabile TALEN- und scTALEN-Proteine zur Entwicklung von resistenten Reis

Koordinator: Prof. Dr. Jens Boch – Leibniz Universität Hannover

Projektbeschreibung

TALEN sind hoch-effizient, hoch-spezifisch und können mit der größtmöglichen Flexibilität aller Genome-Editing-Werkzeuge in komplexem Erbgut positioniert werden. Dennoch ist ihre Konstruktion signifikant mühseliger, als das derzeit favorisierte CRISPR/Cas-System. Dieses Projekt hat es zum Ziel, diesen Aufwand stark zu verringern durch die Produktion maßgeschneiderter, direkt nutzbarer TALEN-Proteine im Hochdurchsatz-Verfahren. Dabei werden mehrere Methoden getestet, um die Löslichkeit und Stabilität von TALEN-Proteinen zu erhöhen, da dieses derzeit Probleme in der Nutzung von TALEN-Proteinen sind. Neben Standardmethoden werden spezielle innovative Ansätze zur Kontrolle der Proteinlöslichkeit durch die Verwendung natürlicher Proteinvarianten oder neuartiger Proteinfusionen durchgeführt.

TALEN werden derzeit immer paarweise verwendet. In einem zweiten Abschnitt des Projektes sollen daher "single-chain-TALEN" (scTALEN) entwickelt werden, die es erlauben monomere TALENs zu nutzen, welches die Anwendbarkeit dieses Genome-Editing-Werkzeuges weiter vereinfachen wird. Um die Aktivität solcher Nukleasen zu erhöhen, wird die DNA-Bindestärke und die DNA-Prozessivität durch die Nutzung von Fusionsproteinen und Hilfsproteinen erhöht. Das Ziel ist es, monomere TALEN zu etablieren, die als lösliches und stabiles Protein angewandt werden können und die eine hohe Aktivität an Zielsequenzen in vivo zeigen.

Im Gegensatz zu CRISPR/Cas, wurde die Spezifität von TALEN im Kontext komplexer Erbinformationen noch nicht ausführlich untersucht. Lösliche und stabile TALEN-Proteine sollen genutzt werden um ihre genomweite Spezifität mittels CIRCLE-seq zu klären. Abschließend werden TALEN-Proteine verwendet, um das Erbgut von Reis an solchen Orten zu editieren, die Virulenzziele natürlicher TALEs reispathogener Xanthomonas oryzae-Bakterien darstellen. Die Multiplex-Editierung solcher Orte werden die natürlichen Virulenzfaktoren inaktivieren und Reispflanzen erzeugen, die resistent gegen diese bedeutenden Reisschädlinge sind. Die Nutzung von TALEN-Proteinen anstelle von DNA oder RNA könnte zu einer breiteren Akzeptanz dieser Technologie führen, da keine fremden Nukleinsäuren übertragen werden und keine transgenen Organismen erzeugt werden. Die geplanten Verbesserungen werden TALEN als Alternative zu CRISPR/Cas neu etablieren und ihre speziellen Vorteile für eine breite Nutzerschaft verfügbar machen.

(english (Beta))

ProTAL
Stabile TALEN- und scTALEN-Proteine zur Entwicklung von resistentem Reis

Projektbeschreibung (en)

TALEN are highly efficient, highly specific, and can be positioned in a genomic context with the greatest flexibility of all genome editing tools. Nevertheless, their construction is significantly more cumbersome than the currently favored CRISPR/Cas system. This project aims to alleviate this burden by generating custom TALEN proteins in a high-throughput measure. Several procedures will be tested to increase the solubility and stability of TALEN proteins which is the current bottleneck in the use of TALEN proteins. Besides standard procedures, specific innovative approaches will be used to control the protein solubility by exploiting natural protein variations or novel protein fusions.

Currently, TALEN are applied in pairs. Thus, in a second part of the project, highly active single-chain-TALEN (scTALEN) will be established to allow the use of monomeric TALENs which will further simplify the applicability of this genome editing tool. To enhance the activity of such nucleases, the DNA-binding strength and the DNA processivity will be enhanced. The aim is to establish a monomeric TALEN which can be applied as a soluble and stable protein and which shows a high in vivo activity at target sites.

In contrast to CRISPR/Cas, the specificity of TALEN in the context of complex genomic DNA has not throughly been assessed. Soluble and stable TALEN proteins will be used to clarify their genome-wide specificity using CIRCLE-seq. Finally, the TALEN protein will be used to edit the rice genome at multiple positions corresponding to virulence targets of natural TALEs from rice-pathogenic Xanthomonas oryzae bacteria. Multiplex editing of such loci will disable the virulence factors and generate rice plants with resistance against these important rice pathogens. The use of TALEN proteins instead of DNA or RNA might allow for a wider acceptance of this technology, because no foreign nucleic acid is transmitted and no transgenic intermediate organism is produced. These optimizations will re-establish TALEN as an alternative to CRISPR/Cas and will make their unique advantages available for a broad usership.

Eckdaten

CROPS OF THE FUTURE

ProTAL

Projektlaufzeit

01.07.2018 - 30.06.2020

Förderkennzeichen

031B0541

Fördersumme

Öffentlich: 368.108,00 €
Privat: 0,00 €
Gesamt: 368.108,00 €
Herr Prof. Dr. Jens Boch
E-Mail-Kontakt
Leibniz Universität Hannover

Herrenhäuser Straße 2
30419 Hannover
Deutschland
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